分子克隆實驗解決方案-第一章：分子克隆實驗概述

分子克隆技術是目前實驗室常用的實驗技術之一，研究者運用該技術能夠將 DNA 片段以體外重組的方式構建至載體，研究者運用該技術能夠將DNA片段以體外重組的方式構建至載體，隨后通過轉化操作導入合適的宿主中復制擴增，最后篩選得到滿足實驗需求的載體克隆。

一、 分子克隆實驗方法

分子克隆研究一般需要將特定 DNA 片段插入至載體形成重組質粒。根據不同的實驗目的，
將常見的分子克隆技術進行分類：
·入門克隆：TA 克隆、TOPO 克隆。
·定向克?。和粗亟M、酶切連接（黏性末端雙酶切反應）。
·定點突變：堿基的插入、缺失與改變。

1.酶切連接

酶切連接作為載體構建實驗最標志性的技術，是利用限制性內切酶（特指 Type II型限制性內切酶）和 T4 DNA 連接酶，完成 DNA 片段 / 載體的重組連接。
限制性內切酶依據結構復雜程度、識別序列、切割位點位置及輔助因子要求分為四類，其中 Type II 型限制性內切酶可識別特異的雙鏈 DNA 序列，切割位點位于識別序列內或臨近識別序列，以內切的方式水解核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵，生成特定 DNA 片段（5’ 端為磷酸基團，3’ 端為羥基）。

T4 DNA 連接酶可以催化相鄰的 5’磷酸基團末端和 3’羥基末端，生成磷酸二酯鍵。

采用酶切連接的方法構建載體時，首先對載體和片段上酶切位點進行分析，因載體和片段需要用相同的限制性內切酶進行消化，因此在選擇酶切位點時，需要選擇載體上含有的特定酶切位點，而目的片段內部不含有該酶切位點（若插入片段內部含有該酶切位點，則在使用限制性內切酶消化插入片段時，會將片段內部切開）。通過 PCR 的方法在目的片段兩端引入線性化載體對應的酶切位點，隨后限制性內切酶對質粒 / 載體和擴增片段進行酶切消化，得到末端序列對應 / 一致的酶切產物并純化，然后使用 T4 DNA 連接酶對純化的酶切產物（片段與載體）進行連接，經過感受態細胞轉化、篩選等操作，最終得到重組質粒。該方法在使用雙酶切線性化時，可實現定向克隆，亦可變換所用載體；但有時會因難以找到適宜的酶切位點及組合，或限制性內切酶切割 DNA 效率低下，造成實驗推進困難。

2. TA 克隆

TA 克隆是指把 PCR 片段與一個具有 3 ’-T 突出的載體進行連接，經過感受態細胞轉化、篩選等操作得到重組質粒的技術。利用 Taq DNA 聚合酶非模板依賴的末端轉移酶活性在雙鏈 PCR 產物的 3’ 末端添加一個 A 堿基，與使用特殊方法處理的具有 3’-T 突出堿基的線性化載體，通過 T/A 配對及 T4 DNA 連接酶的作用進行連接。該方法快捷、高效，但不兼容平末端產物的連接，對于使用高保真酶擴增的平末端產物需要額外進行加A反應。

3. TOPO 克隆

TOPO 克隆是指利用拓撲異構酶的催化作用，完成目的片段與線性載體連接，經過感受態細胞轉化、篩選等操作得到重組質粒的技術方法。拓撲異構酶的核心酶是 DNA 拓撲異構酶I，具有以下幾大特點：
① 同時具有限制性內切酶和連接酶的功能；
② 80% 的連接反應在 2min 內完成 ;
③ 不需要外界提供能量。
因此，拓撲異構酶可以切割一條 DNA 鏈并與 3’ 端 T 的磷酸基團形成共價鍵，使 DNA解旋。隨后，通過線性化 DNA 片段的 5’ 端羥基進攻形成共價鍵，該酶從 DNA 上釋放出來。

為了利用拓撲異構酶的這一連接活性，載體首先利用 TOPO 酶線性化處理制備線性TOPO 載體，隨后加入 DNA 片段完成重組連接。據此，TOPO 實驗的基本原理可簡單理
解為：
① PCR 產物（目的基因）末端的 5 ’-OH 去進攻載體 DNA 和 TOPO 酶之間的磷酸鍵；

② TOPO 酶分子被釋放出來，載體與目的基因形成具有雙切刻的環形重組分子

4. 同源重組

同源重組是指利用重組酶將有末端序列且末端序列一致的兩段序列進行重組，形成環形雙鏈 DNA, 經過感受態細胞轉化、篩選等操作得到重組質粒的技術方法。
 因此在該系統中，需要預先創建同源區域，通過將擴增插入片段的正向和反向 PCR 引物 5’ 端外延 15-20bp 堿基，使這些堿基與線性化質粒載體的末端序列全部匹配，這樣擴增出的插入片段兩端就與線性載體末端序列同源。隨后 Vazyme 的 ClonExpress 同源重組系列核心酶 Exnase，識別這部分同源序列并發揮重組功能。該方法快速、高效，不依賴酶切和連接，不限制目標載體和酶切位點選擇，極易實現定向克隆。

5. 定點突變

定點突變是指利用 PCR 等方法向目的 DNA 片段（此處特指質粒）引入需要的堿基變化，包括堿基的插入、缺失與改變。傳統定點突變系統利用一對反向互補的引物對質粒 PCR 擴增并退火成環，突變位點位于引物中間，PCR 擴增為非指數擴增，存在模板需求量大、DpnI 消化部分導致的假陽性問題。

MutExpress（Vazyme）點突變系統基于 ClonExpress 快速克隆技術，利用一對部分反向互補的引物對質粒 PCR 擴增，使用重組酶針對同源區域重組成環。突變位點位于
引物的反向互補區域，PCR 擴增為指數擴增，模板需求量少，DpnI 可以全部消化，具有超高成功率，使得該系統成為快速、高效改變所需堿基變化的強力選擇。

DpnI 消化原始模板質粒的原理為：DpnI 特異識別模板 GATC 序列，只有當 A 堿基被甲基化時，DpnI 才能進行切割。從克隆用化學感受態細胞（DH5α、Fast-T1 等，非甲基化酶缺陷型）提取出的原始質粒，可被 DpnI 切割消化；PCR 擴增產物不含甲基化修飾，不會被 DpnI 消化。

二、分子克隆實驗方法的選擇

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兼容平末端產物的連接，對于使用高保真酶擴增的平末端產物需要額外進行加 A 反應。困難。