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藥典方案集錦丨應對 2025 版通則聚山梨酯 80 測定法修訂，安捷倫帶你輕松應對輔料分析難題
聚山梨酯是由脂肪酸、山梨坦和環(huán)氧乙烷經(jīng)酯化、聚合而成，最常見的是聚山梨酯 20 和聚山梨酯 80（如圖 1）。聚山梨酯具有較好的生物相容性和低毒性，常在藥物制劑中作增溶劑和乳化劑。近年來，隨著制藥和生物制藥的快速發(fā)展，輔料對藥品安全性的影響日益受到重視，聚山梨酯具有一定的生物和藥理活性，出于用藥安全的考慮，會嚴格控制其在藥物制劑中的含量[1]。
圖 1. 聚山梨酯 20（R=月桂酸?；┖途凵嚼骢?80（R=油酸酰基）的結構式
最新 2025 版藥典四部通則 3203《聚山梨酯 80 測定法》在原來比色法的基礎上增加了第二法熒光膠束法。原有比色法用到銨鈷硫氰酸鹽和二氯甲烷，具有一定的毒性，環(huán)境不友好，且需要復雜的樣品前期準備和處理，而新增的第二法熒光膠束法（HPLC-FLD）采用液相色譜系統(tǒng)內衍生反應，無需樣品前處理，無需色譜柱分離，整個檢測過程在 2 分鐘之內完成，簡單高效，非常適合生物制品及其他藥物制劑中聚山梨酯含量的準確測定。
通則 3203《聚山梨酯 80 測定法》
第二法熒光膠束法熒光膠束法
基于一種疏水熒光染料 N- 苯基 -1- 萘胺（NPN）可與聚山梨酯膠束的非極性疏水性內核結合，這種聚山梨酯膠束 -NPN 復合物的熒光強度與聚山梨酯膠束濃度呈正相關，因此可以對聚山梨酯進行定量測定。
參考 25 版藥典的方法，我們設置了如下的 HPLC-FLD 的液相分析方法：
| 色譜條件 |
衍生反應線圈 | Knitted Reactor Coil 5 m×0.50 mm ID |
流動相 | 0.15 mol/L 氯化鈉、0.05%mol/L 三羥基氨基甲烷（pH=8.0）、5% 乙腈、5μmol/L NPN 和 15μmol/L Brij L23，等度分析 |
流速 | 1.5 ml/min |
柱溫 | 35 ℃ |
進樣體積 | 10 μL |
FLD | 激發(fā)波長 350 nm，發(fā)射波長 420nm，增益設為 7 |
在此條件下，聚山梨酯 80 在 2 min 之內出峰，峰形較好（圖 2），且峰面積穩(wěn)定（如圖 3），而且在高濃度進樣后，系統(tǒng)沒有任何殘留影響。
圖 2. 聚山梨酯 80 的色譜圖
圖 3. 重復進樣 10 針聚山梨酯的色譜圖
同時我們進不同濃度的聚山梨酯 80 的對照品溶液，在 0.3 – 1.1 mg/ml 濃度范圍內線性相關性好（圖 4）。
圖 4. 聚山梨酯標準曲線，線性范圍 0.3-1.1 mg/ml，R2=0.9998
對實際單抗制劑中聚山梨酯 80 的含量進行了準確測定，我們看到實際制劑樣品的峰面積的重復性數(shù)據(jù)特別好。雖然是在衍生管中進行快速的衍生反應，但是衍生的效果穩(wěn)定且可靠，未受到制劑中高濃度抗體的影響?？紤]到有些實驗室環(huán)境溫度變化較大的情況下，可以在衍生管前后加上預加熱器，使衍生過程更穩(wěn)定。
表 1. 三個單抗供試品中聚山梨酯 80 峰面積重復性數(shù)據(jù)
序列 | P1 | P2 | P3 |
1 | 133.979 | 133.631 | 131.77 |
2 | 133.638 | 131.49 | 132.361 |
3 | 133.414 | 132.504 | 132.987 |
4 | 133.72 | 132.407 | 133.066 |
5 | 133.116 | 134.104 | 133.265 |
6 | 133.754 | 133.526 | 132.284 |
7 | 134.186 | 133.535 | 132.954 |
8 | 132.835 | 133.255 | 132.04 |
9 | 132.244 | 134.57 | 132.258 |
10 | 132.695 | 134.151 | 132.915 |
RSD% | 0.46 | 0.70 | 0.38 |
在 HPLC-FLD 方法建立之初，中檢院俞小娟等老師對于 HPLC-FLD 法測定聚山梨酯 80 含量的方法學進行了聯(lián)合驗證[2]，參考文獻的結果，大家可以在安捷倫各種型號的液相上放心使用該方法對聚山梨酯 80 或 20 進行準確檢測分析。
最后，在看似簡單的 HPLC-FLD 分析過程中，有幾個實驗細節(jié)和小伙伴一起分享：
流動相臨用現(xiàn)配，避光保存；對照品溶液臨用現(xiàn)配；
系統(tǒng)平衡：需用高濃度聚山梨酯 80 質控標準品（1 mg/ml）進樣至少 20 針平衡系統(tǒng)；
標準品來源：需用與添加原料同批次同廠家的聚山梨酯 80 作為標準品；
高濃度蛋白干擾：當?shù)鞍诐舛容^高（>20mg/ml）時，出現(xiàn)回收率超限的情況，建議前處理去除蛋白或者樣品稀釋。
結語
安捷倫提供生物制藥輔料的液相分析解決方案文集[3]，內容非常豐富。既對現(xiàn)有聚山梨酯的分析方案進行了拓展，包括采用 HPLC-ELSD 的方法對不同蛋白藥物制劑中的聚山梨酯 80 或者 20 進行準確的含量分析，同時收錄了更多的目前生物制藥行業(yè)制劑中用到的輔料，包括泊洛沙姆 P188，糖類和氨基酸類的分析方法，以及在細胞和基因治療、核酸藥物和疫苗中的遞送載體和佐劑的分析方案。
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參考文獻：
[1] 徐明明，程菁，吳利紅等.HPLC-熒光法測定單抗藥物中聚山梨酯的含量[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2019, 50(9):1047-1051 DOI:10.16522/j.cnki.cjph.2019.09.016
[2] 俞小娟，于傳飛，張榮建等.HPLC-FMA法測定單抗藥物中聚山梨酯80含量的方法學聯(lián)合驗證[J]. 藥學學報,2021,56(8): 2276-2281
[3] 安捷倫生物制藥輔料、載體及生產(chǎn)工藝殘留分析解決方案（第二版）,安捷倫科技公司應用簡報，出版號：5994-4672ZHCN, 2022