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一直被模仿，從未被超越丨Agilent MHC 2D-LC/MS 液質聯用技術介紹及其在生物制藥中的應用案例分享
自 2014年 發布 MHC 2D-LC 系統（多中心切割），Agilent 一直在持續更新并完善 MHC 技術，旨在幫助科研工作者解決實際問題，提高工作效率。
2014 年，MHC 2D-LC 發布，可以一針進樣實現最多 11 個峰的智能存儲，并依次洗脫至二維進行檢測，提高效率，節約樣本；
2016 年，High Resolution Sampling（HiRes, 高頻采樣多中心切割）功能，實現對目標峰的連續 10 片的智能存儲，可用于峰純度研究；
2017 年，Active Solvent Modulation （ASM，主動溶劑稀釋）閥發布，幫助解決一維組分的溶劑洗脫至二維時產生的溶劑效應、鹽效應和溶劑不互溶等問題，增加保留、改善峰型、提高質譜響應；
2017 年，MS Divert 閥發布，輕松將一維切割的組分中不揮發性鹽最大可能去除，有效降低不揮發性鹽帶來的質譜信號抑制；
2021 年，Masshunter 實現對 MHC 2D-LC/MS 的數據采集和數據處理，并新增 Multi inject 實現富集效果，提高低含量雜質的質譜信號；
2022 年，BioMHC 2D-LC 發布，針對生物大分子分析的二維系統，可有效降低傳統不銹鋼系統對目標組分的吸附或質譜信號中存在的加合現象。
Agilent 特色 MHC 2D-LC
技術介紹
多中心切割（MHC）組件
獨特的 MHC 組件（圖 1）由三個閥頭組成，軟件控制閥頭之間聯動，實現一針進樣中最多實現 11 個目標峰的智能存儲和洗脫。兩側閥頭各連接 6 個 loop，實現多個目標峰的存儲，中間的閥頭為雙兩位四通閥，通過閥切換實現 DeckA 或 B 和液相系統流路的連接。
圖 1. MHC 的連接示意圖及 Agilent 2D MHC/TOF 示意圖
獨特的 ASM 功能（圖 2），可有效的降低二維分離時由一維帶來的溶劑效應或鹽效應，特別是 Oligo，當一維洗脫峰的鹽濃度過高時，其在二維的反相離子對系統上會因為保留差而導致質譜信號降低，ASM 可以有效的解決上述問題；同時還可根據需要選擇不同的 ASM 的體積進而實現不同的分流比。
圖 2. ASM 管路為 1uL 的分流比 4:1
Masshunter 軟件
方法設置簡單，只需要將一維紫外譜圖導入（圖 3），點擊紫外譜圖下的目標峰，軟件就能實現對目標峰的智能存儲及洗脫；
圖 3. 點擊目標峰即可輕松實現方法編輯（MHC 數據采集）
一鍵實現所有 cuts 除鹽及除鹽時間的設置（圖 4），設置除鹽時間可以保證質譜信號的質量，同時避免高鹽對質譜的污染；
一鍵設置是否需要使用 ASM（圖 4），避免二維分離的溶劑效應或鹽效應；
圖 4. 方法中的智能的峰存儲及設置所有 cuts 的除鹽時間及 ASM 設置
圖 5. 數據采集時，系統流路狀態的實時顯示
實時顯示峰存儲及洗脫狀態（圖 5），清楚直觀的了解流路狀態；
可實現多種數據采集模式
MHC 采集（圖 3所示）：一針進樣，實現最多 11 個目標峰的智能存儲和質譜鑒定，節約樣本，提高效率;
HiRes 采集（圖 6 所示）：對目標峰的連續切割（可連續存儲 10 片）實現對目標峰純度的評估，如 Peptide 和 Oligo 的主峰純度研究；
圖 6. 對目標峰的連續存儲的 HiRes 模式
HiRes Multi Inject 采集：在 HiRes 模式下，可將連續存儲的峰同時洗脫至二維進行分離檢測，實現低含量雜質的目標峰的質譜鑒定；
MHC 和 HiRes 同時采集：在一針進樣中同時使用這兩種功能時，可在雜質鑒定的同時實現對主峰的純度檢測。
Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF
大分子表征的應用案例——蛋白篇
MHC 應用案例 1
蛋白離子交換酸性堿性峰質譜鑒定
一維分離：Infinity II 1290 Bio 四元溶劑系統，配備 VWD 檢測器
離子交換，A 相：50mM PBS；B 相：50mM PBS，0.2M NaCl，梯度洗脫
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統，反相分離，質譜兼容的反相體系
質譜采集：Agilent 6230 TOF
數據采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結果
1 針進樣，實現了對主峰和酸堿峰總共 5 個目標峰的質譜鑒定，通過解卷積結果發現，酸性峰 A1 和 A2 發生 Deamidation，堿性峰是由 K 的不完全切除導致（B1 和 B2 分別是 +K 和 +2K）。
圖 7. 應用案例 1 分離譜圖及質譜鑒定結果
MHC 應用案例 2
蛋白離子交換酸性堿性峰質譜鑒定
一維分離：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶劑系統，配備 VWD 檢測器
離子交換，A 相：50mM 醋酸鈉（含吐溫 20）；B相：50mM 醋酸鈉（含吐溫 20），0.8MKCl，梯度洗脫
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統，質譜兼容的反相分離
質譜：Agilent 6230 TOF
數據采集及處理：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結果
1 針進樣，并通過二維分離最大程度降低吐溫 20 對蛋白信號的干擾，實現對主峰和酸堿峰共 8 個目標峰的質譜鑒定，并發現酸性峰均發生序列截短，為后續的蛋白表達體統的優化提供數據支持。
圖 8. 應用案例 2 分離譜圖及部分質譜鑒定結果
MHC 應用案例 3
ADC HIC分離不同DAR值的色譜峰鑒定，
實現ADC的DLD測定
一維分離：Infinity II 1260 Bioinert 四元溶劑系統，配備 VWD 檢測器
HIC分離，A 相：2M (NH4)2SO4 溶液，25mM 磷酸鹽；B 相：25mM 磷酸鹽，25% IPA
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統，質譜兼容的反相體系
質譜：Agilent 6230 TOF
數據采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結果
進樣 2 針，實現對主峰 M 和小鋒 N 的 14 個峰的質譜鑒定，確定主峰 DAR0（M1），DAR2（M2），DAR4（M3a 和 M3b），DAR6（M4）和 DAR8（M5）的偶聯類型，其中 DAR4 主要有 2 種偶聯類型，M3a 主要為輕鏈和重鏈鏈間的兩對二硫鍵全部偶聯藥物，M3b 主要為鉸鏈區兩對二硫鍵全部偶聯藥物。
圖 9. 應用案例 3 分離譜圖及部分質譜鑒定結果
這期主要介紹了 Agilent MHC 2D-LC/MS 系統 10 年多完善和創新，并使用 MHC 功能實現蛋白離子交換酸堿峰的質譜鑒定和 HIC 分離 ADC 的 DLD 測定，下期我們將聚焦在 MHC HiRes 和 ASM 功能在 Peptide 和 Oligo 的應用，敬請期待。