在細胞生物學研究中，對細胞膜進行熒光標記和示蹤是觀察細胞行為、分析細胞相互作用以及研究細胞遷移和分布的重要手段。DiD (DiIC18(5))作為一種親脂性熒光染料，憑借其染色機制和優異的性能，成為細胞膜標記領域的理想選擇。

一、DiD 的染色機制與特性

DiD 是一種親脂性熒光染料，其在與細胞膜結合后熒光強度顯著增強。這種熒光增強效應歸因于 DiD 分子與細胞膜脂質雙層的相互作用。DiD 分子具有疏水性，能夠自發地插入到細胞膜的脂質雙層中，并沿著膜平面進行側向擴散。隨著 DiD 分子在細胞膜中的逐漸擴散，整個細胞膜會被均勻染色，發出明亮的熒光。

DiD 的熒光信號穩定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現出色。此外，DiD 對細胞的毒性極低，通常不會影響細胞的正常生理功能和生存力，適用于活細胞的長期示蹤和觀察。DiD 具有很高的淬滅常數和激發態壽命，這意味著它在染色過程中能夠提供更穩定的熒光信號，減少背景噪聲，提高檢測靈敏度。

二、DiD 的應用領域

細胞膜標記

DiD 最常見的應用是對細胞膜進行標記，以觀察細胞的形態和行為。在細胞標記實驗中，將細胞與 DiD 染色液混合孵育，DiD 分子會迅速插入到細胞膜中并發出熒光。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細胞膜的輪廓和形態變化。

DiD 標記的細胞膜熒光信號均勻且穩定，能夠長時間保持熒光強度，適用于多種細胞類型，包括貼壁細胞和懸浮細胞。標記后的細胞可以用于后續的細胞培養、細胞遷移實驗和細胞相互作用研究等。

細胞示蹤

DiD 被廣泛用于細胞示蹤實驗，特別是在神經科學領域。它可以作為正向或逆向的示蹤劑，用于標記和追蹤神經元及其突起。在神經組織切片或活體動物模型中，DiD 標記的神經元可以通過熒光成像技術進行長期觀察，揭示神經元的連接模式、信號傳導路徑以及神經網絡的動態變化。

此外，DiD 還可以用于標記和追蹤其他類型的細胞，如免疫細胞、干細胞和腫瘤細胞等。在體內實驗中，DiD 標記的細胞可以通過熒光成像技術實時觀察其在生物體內的分布、遷移和存活情況，為細胞治療、組織工程和腫瘤轉移等研究提供重要數據支持。

三、DiD 的操作使用方法

染色前準備

在進行 DiD 染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當的緩沖液洗滌細胞，去除殘留的培養基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續的染色和檢測。

染色過程

將準備好的細胞與 DiD 染色液混合，DiD 的常用工作濃度為 5 - 20 μM。將混合后的細胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細胞培養箱中孵育 5 - 30 分鐘。在孵育過程中，DiD 分子會插入到細胞膜中，產生熒光信號。孵育時間可根據細胞類型和實驗需求進行優化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細胞兩次，去除未結合的染料。對于需要進行細胞膜標記觀察的樣本，將標記后的細胞接種到培養皿或培養板中，加入適量的培養基，放入細胞培養箱中進行培養。對于需要進行細胞示蹤實驗的樣本，將標記后的細胞用于后續的體內或體外實驗。使用熒光顯微鏡進行觀察時，設置 650 nm 的激發波長和 665 nm 左右的發射波長檢測通道，收集紅色熒光信號，實現對細胞膜的標記和示蹤。

四、DiD 的優勢與注意事項

優勢

• 低細胞毒性：DiD 對細胞的毒性極低，不會顯著影響細胞的正常生理功能，適用于長期的細胞培養和實驗觀察。

• 良好的細胞膜通透性：DiD 能夠快速穿透細胞膜并插入到脂質雙層中，實現對細胞膜的標記。

• 穩定的熒光信號：DiD 嵌入細胞膜后，熒光信號穩定，不易受到光漂白的影響，適合長時間的熒光觀察和檢測。

• 高淬滅常數和激發態壽命：DiD 具有很高的淬滅常數和激發態壽命，能夠提供更穩定的熒光信號，減少背景噪聲，提高檢測靈敏度。

• 多色熒光標記：DiD 發出紅色熒光，可與其他發出不同顏色熒光的染料（如 DiO、DiI）聯合使用，實現多色熒光標記，為復雜生物過程的研究提供了更全面的視角。

注意事項

• 染色濃度優化：使用 DiD 時，需根據細胞類型和實驗需求優化染色濃度。濃度過高可能導致細胞膜過度染色或細胞毒性增加，而濃度過低則可能使熒光信號不足。

• 避光操作：DiD 染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。

• 背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應充分洗滌細胞，去除未結合的染料。

• 保存條件：DiD 染料應密封保存于干燥、避光的環境中，避免接觸強光和高溫，以保持其活性和穩定性。