在細胞生物學研究中，對細胞膜進行熒光標記和示蹤是觀察細胞行為、分析細胞相互作用以及研究細胞遷移和分布的重要手段。DiR (DiIC18(7))作為一種近紅外熒光的親脂性染料，憑借其染色機制和優異的性能，成為細胞膜標記領域的理想選擇。

一、DiR 的染色機制與特性

DiR 是一種親脂性、近紅外熒光花青染料，其兩個 18-碳鏈能夠深入插入細胞膜的脂質雙層中。這種特性使得 DiR 能夠實現對細胞膜的特定且穩定的染色。當 DiR 與細胞膜結合后，其熒光強度顯著增強，同時光穩定性也得到顯著提升。這種熒光增強效應歸因于 DiR 分子與細胞膜脂質雙層的緊密相互作用。

DiR 的熒光信號穩定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時間的觀察和檢測中表現出色。此外，DiR 對細胞的毒性極低，通常不會影響細胞的正常生理功能和生存力，適用于活細胞的長期示蹤和觀察。DiR 發出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，這使得它在體內實驗中能夠更深入地觀察細胞的分布和遷移情況。

二、DiR 的應用領域

細胞膜標記

DiR 最常見的應用是對細胞膜進行標記，以觀察細胞的形態和行為。在細胞標記實驗中，將細胞與 DiR 染色液混合孵育，DiR 分子會迅速插入到細胞膜中并發出熒光。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細胞膜的輪廓和形態變化。

DiR 標記的細胞膜熒光信號均勻且穩定，能夠長時間保持熒光強度，適用于多種細胞類型，包括貼壁細胞和懸浮細胞。標記后的細胞可以用于后續的細胞培養、細胞遷移實驗和細胞相互作用研究等。

細胞示蹤

DiR 被廣泛用于細胞示蹤實驗，特別是在深部組織的成像研究中。由于其近紅外熒光特性，DiR 標記的細胞在體內實驗中能夠更深入地被觀察，揭示細胞在生物體內的分布、遷移和存活情況。在腫瘤研究中，DiR 標記的腫瘤細胞被用于觀察腫瘤的轉移路徑和侵襲行為，為腫瘤治療策略的開發提供了重要數據支持。

此外，DiR 還可以用于標記和追蹤其他類型的細胞，如免疫細胞、干細胞等。在干細胞研究中，DiR 標記的干細胞被移植到宿主體內后，可以通過熒光成像技術實時觀察干細胞的歸巢、分化和再生能力，為干細胞治療的臨床應用提供了重要的實驗依據。

三、DiR 的操作使用方法

染色前準備

在進行 DiR 染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當的緩沖液洗滌細胞，去除殘留的培養基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續的染色和檢測。

染色過程

將準備好的細胞與 DiR 染色液混合，DiR 的常用工作濃度為 1 - 10 μM。將混合后的細胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細胞培養箱中孵育 10 - 20 分鐘。在孵育過程中，DiR 分子會插入到細胞膜中，產生近紅外熒光。孵育時間可根據細胞類型和實驗需求進行優化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細胞兩次，去除未結合的染料。對于需要進行細胞膜標記觀察的樣本，將標記后的細胞接種到培養皿或培養板中，加入適量的培養基，放入細胞培養箱中進行培養。對于需要進行細胞示蹤實驗的樣本，將標記后的細胞用于后續的體內或體外實驗。使用熒光顯微鏡進行觀察時，設置 780 nm 的激發波長和 810 nm 左右的發射波長檢測通道，收集近紅外熒光信號，實現對細胞膜的標記和示蹤。

四、DiR 的優勢與注意事項

優勢

• 低細胞毒性：DiR 對細胞的毒性極低，不會顯著影響細胞的正常生理功能，適用于長期的細胞培養和實驗觀察。

• 良好的細胞膜通透性：DiR 能夠快速穿透細胞膜并插入到脂質雙層中，實現對細胞膜的標記。

• 穩定的熒光信號：DiR 嵌入細胞膜后，熒光信號穩定，不易受到光漂白的影響，適合長時間的熒光觀察和檢測。

• 近紅外熒光：DiR 發出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，適用于體內深部組織的成像研究。

• 多色熒光標記：DiR 可與其他發出不同顏色熒光的染料（如 DiO、DiI）聯合使用，實現多色熒光標記，為復雜生物過程的研究提供了更全面的視角。

注意事項

• 染色濃度優化：使用 DiR 時，需根據細胞類型和實驗需求優化染色濃度。濃度過高可能導致細胞膜過度染色或細胞毒性增加，而濃度過低則可能使熒光信號不足。

• 避光操作：DiR 染料對光敏感，操作過程中應盡量減少樣本的光照時間，以防止熒光淬滅。

• 背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應充分洗滌細胞，去除未結合的染料。

• 保存條件：DiR 染料應密封保存于干燥、避光的環境中，避免接觸強光和高溫，以保持其活性和穩定性。