小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞的磁珠分選

一、制備脾臟單細(xì)胞懸液

8周齡C57BL/6小鼠摘眼球放血，無菌分離脾臟，于70um濾網(wǎng)上研磨收集脾細(xì)胞，過濾、離心，再以RPMI-1640FD培養(yǎng)液重懸。

二、磁珠標(biāo)記

1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)為8×10⁷/mL。

2. 400×g離心4分鐘，去除上清。

3.每10⁷個(gè)細(xì)胞總量使用40μL緩沖液重懸。

4.每10⁷個(gè)細(xì)胞總量添加10μL CD8+T細(xì)胞生物素抗體混合物。

5.混勻，4℃孵育 5分鐘。

6.每10⁷個(gè)細(xì)胞加入2mL緩沖液洗滌細(xì)胞，400×g離心4分鐘，去上清。

7.每10⁷個(gè)細(xì)胞添加80μL 緩沖液。

8.每10⁷個(gè)細(xì)胞添加20μL抗生物素磁珠。

9.混勻，4℃孵育 10分鐘。

三、磁珠細(xì)胞分選  

1. 將LS分選柱置于相對(duì)應(yīng)的分選器中。

2. 用適當(dāng)體積的緩沖液潤洗分選柱.

3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至分選柱中，收集含有未標(biāo)記細(xì)胞的流出液，即 CD8+T細(xì)胞。

4. 加適量的緩沖液，收集總流出物，并與步驟3中的流出液混合，這是CD8+T細(xì)胞。

四、流式鑒定

1. 將磁珠分選后得到的CD8+T細(xì)胞懸液離心，400 ×g，4min，棄去上清。

2. 細(xì)胞沉淀中加入1 mLFD培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)。

3. 從中取出兩份細(xì)胞（一份大概1×10⁶個(gè)細(xì)胞），設(shè)置為blank和CD8+T染色組。

4. CD8+T染色組加入200 μL流式染色緩沖液，再加入5 μL Anti-Mo CD8a，吹打均勻，常溫避光孵育15min；

5. 孵育結(jié)束后，PBS洗滌細(xì)胞，離心去上清；

6. 加入200 μL流式染色緩沖液，上機(jī)檢測。