腫瘤壞死因子（TNF）是一種促炎細(xì)胞因子，對維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。它通過與TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，
激活炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）通路，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。
不過，TNF引發(fā)的細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡也可能導(dǎo)致多種炎癥性疾病。受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（RIPK1）
是TNF信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點，它能協(xié)調(diào)細(xì)胞的生存與死亡。RIPK1的支架功能可誘導(dǎo)炎癥和細(xì)胞存活，
而其激酶功能則與凋亡和壞死性凋亡相關(guān)。
近日，中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所生物與化學(xué)交叉研究中心許代超團隊與
華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院顧勁揚團隊合作，在 Cell 子刊Molecular Cell 上發(fā)表了題為：
“Palmitoylationlicenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway"的研究論文。
該研究揭示了泛素化依賴性的棕櫚酰化允許RIPK1激酶活性以誘導(dǎo)下游細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)，
并表明RIPK1棕櫚酰化可能是炎癥性疾病的一個可行靶點。這一發(fā)現(xiàn)為理解RIPK1激酶激活提供了新的視角，
并提出了針對RIPK1棕櫚酰化的潛在治療策略。
文章要點
1）TNF刺激下的RIPK1棕櫚酰化
質(zhì)譜分析篩選出三個酰基化蛋白：RIPK1、TNFR1和TAB3。經(jīng)2-BP處理后，RIPK1和TNFR1的棕櫚酰化顯著減少，
表明它們是2-BP敏感的棕櫚酰化底物。在HEK293T細(xì)胞中，2-BP處理使FLAG-RIPK1的棕櫚酰化水平降低，確認(rèn)了RIPK1的棕櫚酰化。
TNF-α刺激下，MEFs中RIPK1的棕櫚酰化水平增加，呈現(xiàn)高分子量條帶，提示泛素化修飾存在。小鼠體內(nèi)實驗也顯示，
TNF-α刺激后肝臟組織中RIPK1的棕櫚酰化水平增加。研究表明，RIPK1在TNF刺激下被棕櫚酰化，且這種棕櫚酰化可被2-BP抑制。
圖1 TNF刺激下的RIPK1棕櫚酰化
2）棕櫚酰化促進(jìn)RIPK1激酶活性
通過優(yōu)化的ABE實驗，使用NMM標(biāo)記并經(jīng)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)RIPK1的Cys257（C257）是主要棕櫚酰化位點。在TNF刺激下，
C257S突變體細(xì)胞系的RIPK1棕櫚酰化顯著降低，其他位點突變影響較小。CRISPR-Cas9技術(shù)生成的Ripk1C257S/C257S敲入小鼠
的MEFs和肝臟組織中，TNF誘導(dǎo)的RIPK1棕櫚酰化也顯著降低。NanoBiT技術(shù)驗證表明，2-BP處理或C257S突變顯著減少RIPK1激酶
結(jié)構(gòu)域的同源相互作用。
這些結(jié)果確定了Cys257是RIPK1的主要棕櫚酰化位點，并揭示棕櫚酰化促進(jìn)RIPK1激酶活性和激酶結(jié)構(gòu)域的同源相互作用。
圖2棕櫚酰化促進(jìn)RIPK1激酶活性
3）棕櫚酰化增加RIPK1細(xì)胞毒性
在MEFs中抑制保護性檢查點并結(jié)合2-BP或RIPK1-C257S突變，可顯著減少TNF誘導(dǎo)的RIPK1激酶依賴性凋亡。
2-BP處理或C257S突變降低RIPK1激酶活性及caspase-3切割，減少復(fù)合物IIb形成，表明RIPK1棕櫚酰化對復(fù)合物IIb組裝至關(guān)重要。
實驗顯示，2-BP處理或RIPK1-C257S突變能提高小鼠在TNF-α刺激下的存活率，
證明抑制RIPK1棕櫚酰化可保護小鼠免受TNF誘導(dǎo)的致死效應(yīng)，且RIPK1棕櫚酰化在促進(jìn)細(xì)胞毒性中起重要作用。
圖3 RIPK1棕櫚酰化增加細(xì)胞毒性
4）DHHC5介導(dǎo)RIPK1棕櫚酰化
通過短發(fā)夾RNA敲低23個DHHC家族成員，篩選出6個PAT，其中DHHC5被驗證為關(guān)鍵的RIPK1棕櫚酰化酶。
在DHHC5敲低或缺失的MEFs中，TNF誘導(dǎo)的RIPK1棕櫚酰化顯著減少，表明其特異性參與且是必要條件。
體外實驗顯示，野生型DHHC5能有效催化RIPK1棕櫚酰化，而催化失活突變體DHHC5-C134S及RIPK1-C257S突變體則不能。
鄰近連接實驗表明，TNF處理后MEFs中RIPK1與DHHC5有顯著相互作用，且在SM-164處理后消失，提示cIAP1/2介導(dǎo)的泛素化
促進(jìn)DHHC5與RIPK1結(jié)合。
免疫沉淀實驗表明，DHHC5在TNF刺激下被募集到復(fù)合物I中，且主要依賴K63連接的泛素鏈。DHHC5是催化RIPK1棕櫚酰化的PAT。
圖4 DHHC5介導(dǎo)RIPK1棕櫚酰化
5）DHHC5促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性
在DHHC5缺失的MEFs中，TNF刺激后復(fù)合物I中的p-S166 RIPK1水平顯著降低，表明DHHC5對RIPK1激酶激活至關(guān)重要。
DHHC5缺失的細(xì)胞對T/5z7誘導(dǎo)的RDA和T/C/Z誘導(dǎo)的壞死性凋亡敏感性降低，且RIPK1和caspase的激活及復(fù)合物IIb的形成減少，
提示DHHC5通過促進(jìn)RIPK1激酶活性調(diào)控復(fù)合物IIb組裝。同時，DHHC5缺失導(dǎo)致p-S166 RIPK1、p-T231/S232 RIPK3、
p-S345 MLKL和壞死小體形成減少，表明其是RIPK1依賴性壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。免疫共沉淀實驗顯示，
DHHC5缺失顯著降低RIPK1激酶結(jié)構(gòu)域之間的同源相互作用，支持DHHC5通過促進(jìn)RIPK1棕櫚酰化增強其激酶活性的觀點。
總之，DHHC5在促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性中起關(guān)鍵作用。
圖5 DHHC5促進(jìn)RIPK1激酶活性和細(xì)胞毒性
6）脂肪酸放大DHHC5促進(jìn)RIPK1驅(qū)動的肝臟損傷
與正常飲食小鼠相比，膽堿缺乏高脂飲食（CD-HFD）小鼠RIPK1棕櫚酰化水平顯著增加，DHHC5蛋白水平顯著升高，
表明在MASH條件下RIPK1棕櫚酰化增強且DHHC5特異性上調(diào)。棕櫚酸（PA）處理原代肝細(xì)胞可提高DHHC5 mRNA和蛋白水平，
且PA處理肝細(xì)胞中c-Jun在DHHC5啟動子區(qū)域結(jié)合增強，表明脂肪酸通過JNK/c-Jun通路誘導(dǎo)DHHC5轉(zhuǎn)錄激活。
在CD-HFD喂養(yǎng)的小鼠中，DHHC5缺失顯著降低RIPK1棕櫚酰化水平，減少RIPK1激酶活性、細(xì)胞死亡、炎癥因子表達(dá)及肝纖維化程度，
表明抑制DHHC5可緩解MASH引起的肝臟損傷。Nec-1s治療CD-HFD小鼠可降低ALT和AST水平，
進(jìn)一步證明RIPK1棕櫚酰化在MASH相關(guān)肝臟損傷中的重要性。
總之，在MASH模型中，DHHC5被脂肪酸放大，增加RIPK1棕櫚酰化和細(xì)胞毒性，導(dǎo)致肝臟損傷加重，而DHHC5缺乏或
RIPK1-C257S突變可有效減輕MASH相關(guān)肝臟損傷。
圖6脂肪酸放大DHHC5促進(jìn)RIPK1驅(qū)動的肝臟損傷
7）RIPK1棕櫚酰化缺陷減輕MASH相關(guān)肝臟損傷
RIPK1-C257S突變可抑制CD-HFD喂養(yǎng)小鼠的RIPK1激活與細(xì)胞死亡，降低血清ALT、AST水平，減少巨噬細(xì)胞浸潤，
降低促炎細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)，減輕肝臟纖維化，Nec-1s處理則削弱該保護作用。
這表明RIPK1-C257S突變通過抑制RIPK1的激活和細(xì)胞死亡，有效減輕MASH相關(guān)的肝臟損傷、炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。
圖7 RIPK1棕櫚酰化缺陷減輕MASH相關(guān)肝臟損傷
文章小結(jié)
研究shou次揭示了泛素化依賴性的棕櫚酰化允許RIPK1激酶活性以誘導(dǎo)下游細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)，并表明RIPK1棕櫚酰化可能是炎癥性疾病的一個可行靶點。
這一發(fā)現(xiàn)為理解RIPK1激酶激活提供了新的視角，并提出了針對RIPK1棕櫚酰化的潛在治療策略。
參考文獻(xiàn)
Zhang N, Liu J, Guo R, et al. Palmitoylation licenses RIPK1 kinase activity and cytotoxicity in the TNF pathway[J]. Mol Cell, 2024,84(22):4419-4435.
